【摘要】 　　目的建立ＨＰＬＣ 梯度洗脫法測定天山花楸葉與果中綠原酸含量的方法。方法采用ＺＯＲＢＡＳ ＯＤＳ Ｃ１８ （４．６ ｍｍ ×１５ ｃｍ，５ μｍ）色譜柱，甲醇－０．０２％磷酸溶液為流動相（梯度洗脫），流速為１．０ ｍｌ· ｍｉｎ－１，檢測波長為３２６ ｎｍ。結果綠原酸線性范圍為３．９５２ ～１９．７６ μｇ／ｍｌ，葉中綠原酸含量１．９８２％ （RSD＝０．５８％，n＝３），平均回收率為９９．４２％；果中綠原酸含量２．２５９％ （RSD＝１．２％，n＝３），平均回收率為９９．３２。結論 該方法經濟、簡便、快速、準確、可靠，可用于該藥材的質量控制。

　　【關鍵詞】  天山花楸 綠原酸 液相色譜法 梯度洗脫

　　Abstract：ObjectiveＴo establish ｍｅｔｈｏｄｓ ｆor ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ Sorbus tianschanica．MethodsＴｈｅ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｌｕｍｎ ｏｆ ＯＤＳ ＺＯＲＢＡＳ ＯＤＳ （４．６ ｍｍ ×１５ ｃｍ，５ μｍ） ｃｏｌｕｍｎ ａｎｄ ＭｅＯＨ －０．０２％Ｈ３ ＰＯ３ ａｓ ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ．Ｔｈｅ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ｗａｓ １．０ ｍｌ· ｍｉｎ－１ ．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉon ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ３２６ ｎｍ．ResultsＴｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｌｉｎｅａｒ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ３．９５２ ～１９．７６ μｇ／ｍｌ．Ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅａｆ ｏｆ S．tianschanica ｗａｓ １．９８２％（RSD％ ＝０．５８，n＝３）ａｎｄ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ９９．４２％. Ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｔｈｅ ｆｒｕｉｔ ｏｆ S．tianschanica ｗａｓ ２．２５９％（RSD％ ＝１．２，n＝３） ａｎｄ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ９９．３２％．ConclusionＴｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｓｉｍｐｌｅ， ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ， ｑｕｉｃｋ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｉｔ ｉｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ Ｓ．ｔｉａｎｓｃｈａｎｉｃａ．

　　Key words：Sorbus tianchanica；  Ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ；  ＨＰＬＣ；  Ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ

　　薔薇科Rosaceae 花楸屬植物天山花楸Sorbus tianschanica，為維吾爾和哈薩克族民間常用藥材。藥理實驗顯示［１ ～３］ ，天山花楸枝葉兼有止咳、平喘、強心等多種藥理功效，并且毒性很低。綠原酸是天山花楸中有效成分之一，廣泛存在于自然界，屬于咖啡酰奎尼酸衍生物，是植物體內有氧呼吸過程中經莽草酸途徑產生的一種苯丙素類化合物，為眾多藥材抗菌解毒、消炎利膽的主要有效成分。綠原酸除了抗氧化能力強外，還具有抗艾滋病毒、抗過敏、抗腫瘤等功能［４ ～７］ 。由于天山花楸中的綠原酸定量研究尚未見報道，為了了解天山花楸中綠原酸的含量，更全面、綜合地評價這一藥用植物，更好地控制藥材質量，開發傳統中藥材的潛力，我們建立了測定天山花楸葉與果中綠原酸的液相色譜方法［８，９］ 。

　　1  儀器與試藥

　　Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰ１１００ 型液相色譜系統，配有：四元泵，紫外檢測器，ＨＰ１１００ 化學工作站；日本島津ＵＶ ２４０１（ＰＣ）紫外光譜儀；德國Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＢＰ２１１Ｄ 十萬分之一電子分析天平；索氏抽提裝置；甲醇為色譜純，水為二次重蒸水，其他試劑均為分析純；天山花楸供試品自制；綠原酸對照品由中國藥品生物檢定所提供。

　　2  方法與結果

　　2.1  色譜條件色譜柱為ＺＯＲＢＡＳ ＯＤＳ Ｃ１８ （４．６ ｍｍ ×１５ ｃｍ，５μｍ）色譜柱，檢測波長為３２６ ｎｍ；柱溫３５℃；流速１．０ ｍｌ·ｍｉｎ－１ ；進樣量２０ μｌ。流動相洗脫梯度見表１。

　　表1  流動相梯度洗脫（略）

　　2.2  對照品溶液和供試品溶液制備

　　2.2.1  綠原酸對照品溶液稱取綠原酸對照品約２０ ｍｇ，精密稱定，置１００ ｍｌ 棕色容量瓶中，甲醇溶液稀釋至刻度，作為貯備液。精密吸取貯備液５ ｍｌ，置２５ ｍｌ 棕色容量瓶中，加甲醇溶液至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

　　2.2.2  天山花楸葉供試品取６０ ℃常壓干燥至恒重天山花楸葉粉末約０．５ ｇ，各３ 份，置索氏提取器中，加乙醚約８０ ｍｌ，加熱回流至無色，棄去乙醚，藥渣揮干，再加甲醇８０ ｍｌ，加熱回流提取至無色，轉移至１００ ｍｌ 容量瓶中，甲醇定容，即得待測天山花楸葉供試品溶液。

　　2.2.3  天山花楸果供試品取３ 份６０ ℃常壓干燥至恒重的天山花楸果實粉末約０．５ ｇ，置索氏提取器中加甲醇８０ ｍｌ，加熱回流提取至無色，移至１００ ｍｌ 容量瓶中，甲醇定容，即得待測天山花楸果供試品溶液。

　　2.3  線性關系考察及穩定性實驗精密移取１．０，２．０，３．０，４．０，５．０  ｍｌ 綠原酸對照品溶液，分別置１０ ｍｌ 棕色容量瓶中，用０．４５ μｍ 濾膜過濾，收集續濾液，進樣量２０ μｌ，按上述色譜條件測定。以基線構成之面積稱峰面積。A＝×σ×h＝2.507σh＝1.064 Wh/2h>峰面積Ａ 對對照品濃度（μｇ／ｍｌ）進行線性回歸，得標準曲線回歸方程：A＝４６．１０７C－５９．５３２，r＝０．９９９ ６。綠原酸線性范圍為３．９５２ ～１９．７６ μｇ／ｍｌ。取上述對照品溶液，每隔２ ｈ 按上述色譜條件測定峰面積，結果表明在１２ ｈ 內基本穩定（RSD＝２．８％）。

　　2.4  精密度實驗精密移取對照品液２．０ ｍｌ，置１０ ｍｌ 棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，照“２．３”項下進樣，連續進樣５ 次，綠原酸含量RSD＝２．７％。

　　2.5  重復性實驗精密量取已知綠原酸含量的葉與果供試品溶液０．８ ｍｌ，移至１０ ｍｌ 棕色容量瓶中，甲醇定容，照“２．３”項下進樣，連續進樣５ 次，葉的綠原酸含量RSD＝２．８％；果的綠原酸含量RSD＝０．７４％。

　　2.6  回收率實驗精密移取已知綠原酸含量的樣品０．８ｍｌ，置１０ ｍｌ 棕色容量瓶中，精密加入定量低、中、高濃度的對照品液，加甲醇稀釋至刻度，照“２．３”項下操作測定。葉：平均回收率＝９９．４２％，RSD＝２．１％（n＝９）；果：平均回收率＝９９．３２％，RSD＝２．４％（n＝９）。

　　2.7  樣品測定精密量取供試品溶液０．８ ｍｌ，移至１０ ｍｌ 棕色容量瓶中，甲醇定容，照“２．３”項下進樣，代入標準曲線，即得。結果：天山花楸葉中綠原酸的平均含量為１．９８２％， RSD ＝０．５８％（n＝３）；天山花楸果中綠原酸的平均含量為２．２５９％，RSD＝１．２％（n＝３）。見圖１。

　　圖１  綠原酸ＨＰＬＣ 色譜圖（略）

　　3  討論

　　對照品綠原酸對其進行紫外掃描，綠原酸在３２６ ｎｍ 有較強吸收，因此選擇３２６ ｎｍ 為測定波長。

　　曾選擇甲醇－０．０２％磷酸溶液（１０∶９０）的等度洗脫色譜條件，但綠原酸保留時間過長，ｔＲ 為１４ ｍｉｎ， 一次檢測完成約需３０ｍｉｎ。經摸索后采用梯度洗脫，使待測組分綠原酸以較短時間ｔＲ為４．４ ｍｉｎ 出峰，隨后使洗脫梯度變大，流動相的極性也變大，極性弱的組分快流出柱。

　　【參考文獻】

　　［1］ 李迪民．天山花楸水提液藥理學研究［ Ｊ］．中草藥，１９９５，２６（６）：３０２．

　　［2］ 李迪民，陳 堅．天山花楸醇提取物藥理作用的研究［Ｊ］．西北藥學雜志，１９９９，１４ （１）：１４．

　　［3］ 于 明，李 銑．花楸屬植物化學成分藥理作用及其研究進展［Ｊ］．遼寧中醫學院學報，２００４，６（５）：３６４．

　　［4］ 高錦明，張鞍靈，張康健，等．綠原酸分布、提取與生物活性研究綜述［Ｊ］．西北林業學院學報，１９９９，１４（２）：７３．

　　［5］ 張鞍靈，馬 群，高錦明，等．綠原酸及其類似物與生物活性［Ｊ］．中草藥，２００１，３２（２）：１７３．

　　［6］ 胡克杰，孫考祥，王憬璐，等．綠原酸體外抗病毒作用研究［Ｊ］．哈爾濱醫科大學學報，２００１，３５（６）：４３０．

　　［7］ 尉 芹，馬希漢．綠原酸及其提取分離方法評述［Ｊ］．中成藥，２００１，２３（２）：１３５．

　　［8］ 解成喜，張麗靜，范維剛．反相液相色譜法測定羅布麻葉中綠原酸的含量［Ｊ］．分析實驗室，２００６，２５（２）：１６．

　　［9］ 李建中，馬 良，崔 同，等．山楂果實中主要活性物質的液相色譜分析［Ｊ］．色譜，２００５，２３（１）：１１．

本篇文章來源于 液相色譜法測定天山花楸中的綠原酸含量|科學儀器在線